什么是内毒素(上)

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内毒素检测知多少(上篇)

来源:作者:人气:-发表时间:2019-10-28 14:08:00【
内毒素endotoxin)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来,所以叫做内毒素。
肠道杆菌多为革兰氏阴性杆菌,具有内毒素,若引起败血症、脑膜炎等感染时,可用血液、脑脊液及体液等检测内毒素,以协助临床诊断。另外,在生产药剂等过程中,自然环境中产生内毒素的细菌也常污染注射制剂、生物制品等,出厂前也要严格检查。内毒素的检测在现代临床生物技术中越发显得重要,西宝生物作为Wako的一级代理商致力于生命科学领域十多年,可为广大客户提供内毒素检测的整体解决方案,从仪器设备和相关试剂和耗材等
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【什么是内毒素】
内毒素一种在革兰氏阴性菌细胞壁中发现的脂多糖(LPS)。它是一种典型的热原,哪怕是皮克级(10-12g)或纳克级的(10-9g)内毒素进入血液,也会引发各种生物反应。因为其有着耐热性和稳定性,通过高压蒸汽处理也不能完全使内毒素灭活,需在250℃或以上的温度下,干热处理至少半小时才能使其灭活。它存在于革兰氏阴性菌栖息的环境中(例如水,空气),即使在细菌死亡后,细菌性的内毒素(LPS)仍然存在。
图1. 脂多糖(LPS)结构示意图
图1为脂多糖的结构图如图所示,脂质A在该物质中是负责生物活性的主要部分,这部分的分子量约为2000。包含糖链部分在内的整个分子的分子量一般为5000到8000左右。然而,因为内毒素是一种同时拥有亲水区(糖链)和疏水区(脂质A)的分子,它能在水溶液中相互缔合,形成表观分子量为数十至数百万的胶束结构。有报告指出,胶束结构的变化,会影响其生物活性的强弱。
图2. 脂质A的结构(大肠杆菌型和沙门氏菌型)
图2所示为大肠杆菌型和沙门氏菌型的脂质A的结构。从图中能看出即使菌株不一样,脂质A的基本结构在大体上仍然相同。
【使用鳌阿米巴样细胞溶解物(LAL)试剂的各种内毒素检测方法】
由马蹄蟹(美洲鲎)的阿米巴样细胞溶解物制备的试剂可用于检测细菌内毒素。如图3所示,在内毒素的参与下,级联反应开始进行,其中C因子,一种丝氨酸蛋白酶前体,最先被活化。随后接下来的是B因子的活化,B因子也是一种丝氨酸蛋白酶前体和凝固酶前体,它能将凝集原水解成凝集素,形成不溶性凝胶。
在LAL测试中,内毒素可以通过三种方式定量:
  1. 对凝胶的形成进行测定
  2. 对浊度的增加进行测定
  3. 或对由合成底物分解而释放出的黄色色原体进行测定。
普通的LAL试剂不仅与内毒素反应,而且会与(1→3)-β-D-葡聚糖(真菌细胞壁成分)反应,因为G因子途径会在LAL试剂作用下被激活。为了消除这种(1→3)-β-D-葡聚糖活化,在工业中通过去除G因子或抑制其活化,开发了各种内毒素特异性试剂。
市场上有着各种基于图3中的反应机理所制得的LAL试剂以及检测体系。因此,根据所需的准确度、测试频率、样本数目以及其他相关因素来选择最合适的产品是十分重要的。
图3. LAL试剂反应机理
美国,欧洲和日本的药典中包含了三种内毒素检测方法,分别是凝胶法、比色法和比浊法,我们会在下面的章节中详述,并且会介绍相关的LAL试剂的特点以及其应用实例。
(1) 凝胶法
将样本与LAL试剂在试管中混合,并使用干浴器,在37±1°C下,孵育60±2 min,期间不要振动。加热完成后,立即缓慢地将试管倾斜180°。如果凝胶已形成并能保持其完整性而不变形或塌陷,则结果可确定为阳性,而如果未形成凝胶则为阴性。在检测期间,对于一系列样本,要进行多倍稀释(通常为2倍),以检查每个样品的结果是否为阳性。确定为阳性的最大有效稀释倍数或最小浓度被称为终点。
相关试剂:
在单次型试剂盒和多次型试剂盒中都包含LAL试剂,其中单次型试剂盒中的反应小瓶包含了预分装好的用于单次检测的LAL试剂,而多次型试剂盒则是将所需量的已经溶解好的LAL试剂装入到反应瓶中。单次型试剂盒非常适用于少量样品的检测,而多次型试剂盒则适用于样本量更多的检测。
多次型试剂盒的使用方法式是将0.1 mL已经溶解好的LAL试剂分装到反应管中,然后再加入0.1 mL样品,并将其混合。而单次型试剂盒的使用方法则是将0.2 mL样本加入到含有预先分装好的LAL冻干试剂的反应小瓶中。
ES-II系列
特异性内毒素LAL试剂(不会被(1→3)-β-D-葡聚糖活化),与细菌内毒素检测(BET)(日本药典)相兼容。其胶凝灵敏度为0.015 EU/mL,单次型和多次型试剂盒均有提供。
(2)比色法
由于内毒素会使LAL试剂活化,比色法是根据其对显色底物的分解来检测其活化。由于对硝基苯胺的黄色的吸光度是在405 nm波长下检测的,如果样品在约405 nm波长下具有相当大的光吸收,则不宜使用比色法。
相关试剂
Color KY 系列
内毒素特异性比色法LAL试剂,与BET(日本药典)一致性测试相兼容。与Toxinometer® 结合使用的单次型试剂盒,以及与酶标仪和Toxinometer® 结合使用的多次型试剂盒,可用于动态比色测试。这些系列在我们的试剂产品有着最高的灵敏度:检测限为0.0002 EU/mL(单次型)和0.0005 EU/mL(多次型)。
(3)比浊法
比浊法利用凝胶浊度的变化来检测由内毒素诱导所产生的LAL试剂的活化。它不适用于具有一定浊度的样品。
ES-F系列和ES-II系列
在动态比浊法测量中,可以将ES-F系列、ES-II系列与酶标仪和Toxinometer® 结合使用。这些试剂盒不仅能获得凝胶法的结果,同时能得到动态比浊法的数据,测量时间为60 min。
【对检测用具的要求】
用于内毒素检测的所有检测用具必须不含内毒素和β-葡聚糖。为使内毒素失活,需要在250°C下干热处理超过30 min。建议使用经干热灭菌的玻璃器皿。避免使用金属工具,因为即使有少量被洗脱出的金属离子(例如铁,铝,镓,铬),也可能影响测试。而当使用一次性塑料工具(其制造商未能保证其能用于检测用途)时,检查它们是否满足以下要求(与玻璃器皿相比):1)未被内毒素污染; 2)不吸附内毒素; 3)无洗脱物。
【内毒素产品列表】
货号
品名
规格
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR (TM) ES-F SINGLE TEST SENSITIVITY 0.015 EU/mL (25 LAL Reagent vials + 1 CSE vial)
鲎阿米巴样细胞裂解物PYROSTAR™ES-F单次测试 灵敏度0.015 EU/mL
25 tests
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F MULTI TEST (without CSE)
鲎阿米巴样细胞裂解物PYROSTAR™ES-F多次测试(不含CSE)
100 tests
Limulus ES-2 Single Test wako
鲎试剂ES-2 Single(适用于溶胶凝胶法和动态比浊法)
25 tests
Limulus ES-2 Test wako
鲎试剂ES-2 (适用于溶胶凝胶法和动态比浊法)
60 tests
Limulus Amebocyte Lysate ES-II, Lyophilized
鲎试剂LAL ES-II(适用于溶胶凝胶法和动态比浊法)
2 ml×5
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F/Plate (with CSE)
鲎阿米巴样细胞裂解物PYROSTAR™ES-F/板(含CSE)
160 tests
Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR ES-F/Plate (without CSE)
鲎阿米巴样细胞裂解物PYROSTAR™ES-F/板(不含CSE)
200 tests
Limulus Color KY Single Test wako
鲎试剂比色法KY单次测试
25 tests
Limulus Color KY Test Wako
鲎试剂比色法KY多次型
60 tests
290-33771
Toxinometer ET-6000/J Standard Set
内毒素检测仪ET-6000/J
1 set
291-35761
Toxinometer ET-7000/J Standard Set
内毒素检测仪ET-7000/J(升级版)
1 set
※ 上述产品仅供实验使用,不可用于临床诊断。
未完待续,欲了解更多内毒素相关的精彩内容请关注西宝官网,留意下次发布的文章《什么是内毒素?(下篇)》
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